Princípios de espectroscopia de fluorescência 2
Princípios de espectroscopia de fluorescência
20/10/2026
Espectroscopia de absorção X espectroscopia de emissão
A figura 4 apresenta uma configuração típica de um espectrofotômetro UV/Vis e de um espectrofluorímetro. Ambos apresentam uma amostra que é irradiada com luz monocromática, oriunda de uma fonte de luz que é passada através de um monocromador. O detector no caso de UV/Vis detecta a luz que atravessa a amostra (espectroscopia de absorção). Por outro lado, um espectrofluorímetro detecta luz fluorescente emitida em uma direção a 90º, que atinge um detector após atravessar um monocromador de emissão (espectroscopia de emissão).Fig. 4 UV/Vis spectrometer (top) and spectrofluorometer (bottom)
No espectro de emissão, o comprimento de onda de emissão (Em) é fixo e o de excitação (Ex) é submetido à uma varredura, de maneira a medir a intensidade de fluorescência. O comprimento de onda que promove a intensidade de fluorescência máxima é determinado como comprimento de onda de excitação máxima. O formato do espectro de excitação é similar ao espectro de absorção (figura 5).
Um espectro de fluorescência é obtido ao se fixar o comprimento de onda Ex e realizando-se a varredura dos comprimentos de onda Em. Apesar da variação da intensidade de fluorescência de acordo com o comprimento de onda de excitação, pode-se perceber que os perfis espectrais são similares (figura 5).
Fig. 5-1 Absorption spectrum and excitation spectrum
Fig. 5-2 Fluorescence spectra at different excitation wavelengths
Fig. 6 Franck-Condon absorption spectrum: vibration levels in excited and ground states (top),
mirror image relationship between absorption and fluorescence spectra (bottom)
Vantagens da espectroscopia por fluorescência
Alta sensibilidade
Espectroscopia de absorção percebe reduções de intensidade de luz incidente, ao passo que a espectroscopia de fluorescência detecta a intensidade de luz emitida. Trata-se de um modelo mais sensível pois detecta diferenças com base em uma intensidade de emissão inicial igual a zero.
Alta seletividade
Marcações fluorescentes específicas são possíveis ao se ligar moléculas fluorescentes à analitos de interesse.
Alta dependência de ambiente
O sinal e formato de um espectro de fluorescência é sensível ao ambiente no qual um analito se encontra (pH de solução, temperatura, tipo de solvente, presença de sais). Esta característica pode ser utilizada a favor do pesquisador, de modo a realizar análises do ambiente que envolve um analito em particular.
Informações moleculares que podem ser obtidas através
do emprego de espectroscopia de fluorescência:
Quantificação de analitos
Comprimento de excitação ótimo
Informação sobre o ambiente que envolve um analito específico (pH de solução, temperatura, tipo de solvente, presença de sais).
Tempo de vida de fluorescência e fosforescência
Despolarização
Rendimento quântico